Cytoplasm protein Extraction from Arabidopsis

Protocol from Isolation of Nuclear Proteins. Setsuko Komatsu. Methods Mol Biol. 2007:355:73-7. doi: 10.1385/1-59745-227-0:73.

Nuclear Extraction from Arabidopsis thaliana. Fang Xu and Charles Copeland. Bio-protocol. Vol 2, Iss 24, Dec 20, 2012. doi:10.21769/BioProtoc.306.

Procedure:

1. Collect fresh plant tissue and grind the tissue to a fine powder in liquid nitrogen. Add Lysis Buffer at a ratio of 1 mg/3 mL, and homogenize the mixture by gentle shaking;
2. Filter the sample through a filter membrane into a new centrifuge tube and operate on ice throughout the process. After filtration, centrifuge at 1,500 g and 4 ℃ for 10 minutes;
3. Transfer the supernatant to a 1.5 mL centrifuge tube with a volume of 1 mL per tube, then centrifuge at 13,000 g at 4 ℃ for 10 minutes;
4. Transfer the supernatant to a new centrifuge tube to obtain cytoplasmic protein. Add protease inhibitor cocktail (Roche) to the extracted protein;
5. Measure protein concentration;
6. Denaturation: Add 5 x Laemelli Buffer to the protein sample at a ratio of 4:1, denature at 70 ℃ for 10 minutes, and store at -80℃.

Solutions Required

Lysis Buffer

1M   Tris-Hcl (PH=7.5)                              1mL

1M   Kcl                                                       1mL

0.5 M EDTA                                             200μL

1M  Mgcl2                                                125μL

25% Glycerol                                       12.5mL

250 mM Sucrose                                4.278g

1M DTT                                                    250μL

Protease inhibitor cocktail (Roche)

                                                                                     

                                       Add ddH2O to 50mL

 

 

NRBT buffer

1M   Tris-Hcl (PH=7.5)                          4 mL

1M  Mgcl2                                          500 μL

25% Glycerol                                      50 mL

10% Trixon-100                                      4 mL                   

Protease inhibitor cocktail (Roche)

                                                                                     

                                 Add ddH2O to 200mL

 

5×Laemelli Buffer                  

1 M Tris-Hcl (PH=6.8)                       0.875mL

Glycerol                                                  4.5mL

SDS                                                          0.5g

0.25% Bromophenol blue                   0.5mL

2-ME                                                      1.25 mL

                                                                                     

                                         Add ddH2O to 10mL